Métodos Alternativos ao Kjeldahl para Análise de Proteínas

O método de Kjeldahl foi proposto em 1883 por um químico Dinamarquês, ele descobriu um processo para determinar Nitrogênio Total em matéria orgânica, que se provou também um método muito confiável para determinação indireta de proteína bruta, feita através de um cálculo a partir do Nitrogênio Total. Ainda hoje é um método confiável e usado amplamente para determinação de proteína em alimentos e nitrogênio em solos e plantas.

Esse método é feito em três etapas distintas: digestão da amostra, por ação de ácido sulfúrico concentrado, destilação do nitrogênio e, por fim, titulação ácida.

Mas esse método apresenta alguns problemas, como o longo tempo de preparo, a grande necessidade de reagentes, vidrarias e equipamentos de laboratório. Além disso, hoje é muito debatido sobre como reduzir os produtos químicos lançados no meio ambiente, tendo em vista as políticas ambientais, as recomendações são substituir ou reduzir o uso de reagentes, ou ainda, modificar completamente os procedimentos em uso.

Alguns estudos já comparam o método de Kjeldahl com outros métodos de determinação de proteínas, como a Espectroscopia NIRS e o método de Dumas.

Neste artigo discutiremos a respeito da análise usando o método de Kjeldahl e outros métodos alternativos ao Kjeldahl, como NIR e Dumas.

Métodos Instrumentais

O método de Kjeldahl é feito de maneira clássica, o que torna ele perigoso, devido ao uso de ácidos, demorado e exige um trabalho intensivo de múltiplas etapas.

Por conta da necessidade de métodos alternativos, um número de métodos instrumentais rápidos e precisos foram gradualmente introduzidos, com algumas vantagens em comparação com esse método, como o método NIRS e o método de Dumas que são técnicas instrumentais, elas possuem os efeitos positivos de reduzirem o erro do operador, já que exigem menos manuseio das amostras, diminuindo as chances de erro no preparo, um problema que pode ser comum no método de Kjeldahl e trazer um grande retrabalho. Bem como cada método possui seus aspectos positivos e negativos se comparado ao Kejldahl, o principal problema dos métodos instrumentais são os custos inicias de obtenção dos equipamentos, que podem não justificar uma troca em caso de uma necessidade de análise de poucas amostras. Em contrapartida, em casos que uma grande quantidade de análise precisa ser feita, métodos instrumentais entregam um resultado de maneira muito mais rápida e mais econômica a longo prazo.

Aspectos negativos do método de Kjeldahl:

Embora hoje o método de Kjeldahl seja o método padrão para análises de Nitrogênio em diversas matrizes, ainda existem diversos aspectos negativos que devem ser levados em consideração.

Processo longo: De longe o maior problema é a demora do processo, que também envolve diversas etapas.

Já existem alternativas que demoram de 45-300s, que se comparado as 6 horas médias do procedimento se torna muito vantajoso.

Risco ocupacional: O método exige o manuseio de ácidos e aquecimento a altas temperaturas, isso pode gerar um acidente.

Destruição da amostra: Para analisar a amostra você precisa digerir, causando a perca dela, existem métodos alternativos em que isso não ocorre.

Erro na análise: Métodos longos e de múltiplas etapas aumentam a chance de retrabalho em caso de erro do analista responsável.

Necessidade de reagentes químicos: Um dos temas da atualidade é a redução do uso de reagentes químicos, o método exige além do uso de ácidos e indicadores, o uso de Selênio (dependendo do procedimento) que apresenta toxicidade para humanos. Além disso, gera um custo frequente com a compra mensal desses reagentes, enquanto existem métodos que não usam nenhum reagente.

Estrutura laboratorial: Para realizar as três etapas do método você precisa de capela, exaustão, bloco digestor, vidrarias e outros equipamentos. Isso gera também um custo de reposição frequente.

Alguns dos aspectos negativos já possuem procedimentos que buscam reduzir o impacto, como por exemplo o impacto ambiental e o custo no procedimento de Kjeldahl, veja o artigo: O Método de Kjeldahl e como reduzir os custos da análise de nitrogênio e proteína.

Conhecendo outros métodos

Espectroscopia de Infravermelho Próximo (NIRS)

A Espectroscopia de Infravermelho Próximo, também conhecida como NIR ou NIRS, é uma técnica que permite analisar principalmente amostras orgânicas (e algumas inorgânicas) através da emissão de radiação eletromagnética no infravermelho próximo de 780nm a 2500nm. Isso significa que ele pode fazer a análise de diversos parâmetros, e não só a de proteínas, o que fez com ele seja considerado uma das melhores formas de se analisar alimentos e outras amostras orgânicas.

Além disso, estudos¹ mostram como o método apresenta resultados idênticos ao Kjeldahl e com uma reprodutibilidade superior na análise de proteínas. Bem como o método não tem grande parte dos aspectos negativos do método de Kjeldahl.

Aspectos positivos do NIR:

Análise rápida: O tempo de análise de um equipamento NIR varia com o fabricante, mas é possível obter o resultado em cerca de 45 segundos.

Análise multiparâmetros: Um equipamento NIR não obtém apenas o resultado da análise de proteínas, no mesmo equipamento e análise ele obtém o resultado de diversos parâmetros como: proteína, umidade, pH, lactose, glúten, cinzas, proteína, açúcares, porcentagem alcoólica e muitos outros.

Sem preparo: Pode ser analisado qualquer tipo de amostra, amostras líquidas ou sólidas, sem preparo prévio, isso faz com que não seja destruída e perdida a amostra.

Sem reagentes: Os equipamentos NIR não precisam de reagentes, padrões ou gases para funcionar.

Sem necessidade de estrutura específica: Só é necessária uma fonte de energia.

Pode ser automatizado: Ele pode ser usado em uma indústria para medição de várias amostras seguidas e é fácil de usar.

O método NIR possui um uso amplo, que vai além da determinação das proteínas, por isso ele é frequentemente usado no controle de qualidade de indústrias alimentícias e em laboratórios de universidades.

Veja um vídeo com a demonstração da análise de uma amostra de Carne:

Você pode ler mais informações sobre o método acessando este artigo: O que é a Espectroscopia de Infravermelho Próximo (NIR)?

Método de Dumas

O método de Dumas para determinação de nitrogênio é baseado na digestão por combustão quantitativa de a amostra em aproximadamente 900°C em excesso de oxigênio. A amostra é queimada e os elementos orgânicos são oxidados. Os gases de combustão (O2, CO2, H2O, N2 e óxidos de nitrogênio NOx) são coletados e passados através de várias etapas. Todos os gases são eliminados exceto nitrogênio e óxidos de nitrogênio. Os gases de análise são transferidos com CO2 como gás de arraste por meio de um catalisador zona de pós-combustão para uma zona de redução. Neste ponto, ocorre a conversão dos óxidos nítricos em nitrogênio em um tungstênio quente. Além disso, o excesso de oxigênio está ligado. Depois de duas etapas de secagem, a mistura gasosa flui para o detector de termo condutividade através de um fluxo eletrônico controlador. Um computador conectado calcula a concentração de nitrogênio na amostra do sinal TCD do N2 no CO2 e do peso da amostra. O teor de proteína bruta é calculado por multiplicando a quantidade medida de nitrogênio pelo fator apropriado (6,25 na maioria das vezes) e é expresso em por cento.

Vantagens do método Dumas:

Mais rápido: A medição dura menos de 4 minutos.

Sem necessidade de reagentes: Não usa reagentes químicos ou catalisadores.

Pode ser automatizado: Ele pode ser usado em uma indústria para medição de várias amostras seguidas e é fácil de usar.

Dentre as desvantagens do método está principalmente os altos custos iniciais, além de ser um método destrutivo que usa uma pequena quantidade de amostra, fazendo com que seja difícil obter uma amostra representativa.

Outros métodos

Existem outros métodos descritos em artigos para a determinação de Nitrogênio ou de Proteínas, como métodos colorimétricos que são feitos com Instrumentos de Espectrometria UV-VIS, ou outros métodos clássicos, como o método de Hach, método de Lowry ou método de Bradford.

Fontes:

1. Souza, Gilberto; et al. Avaliação da repetibilidade e reprodutibilidade de métodos de proteína bruta: estudo colaborativo. Congresso Brasileiro de Metrologia. 2015. Disponível em: <https://www.embrapa.br/busca-de-publicacoes/-/publicacao/1040044/avaliacao-da-repetibilidade-e-reprodutibilidade-de-metodos-de-proteina-bruta-estudo-colaborativo>. Acesso em: dezembro de 2022.

Mihaljvel, Zeljko A.; Et, al. Comparison of the Kjeldahl method, Dumas method and NIR method for total nitrogen determination in meat and meat products. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies, Temerin, Serbia, 2015, 21(4), 365-370. Acesso em: dezembro de 2022.

Mæhre, H.K.; Dalheim, L.; Edvinsen, G.K.; Elvevoll, E.O.; Jensen, I.-J. Protein Determination—Method Matters. Foods 2018, 7, 5. Disponível em: <https://www.mdpi.com/2304-8158/7/1/5>. Acesso em: dezembro de 2022.